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显微操作技术


更新时间:2010-05-13



显微操作技术(MicromanipulationTechnique)是指在高倍倒置显微镜下,利用显微操作器(Micromanipulator),控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置,用来进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。

目前,以细胞内微注射和微灌注技术为基础的玻璃针头(GlassNeedle,精细的玻璃微量毛细移液管)的使用,已经在越来越多的实验生物学研究领域中成为一项非常普遍的操作方法,比如在体外受精、转基因中等等。描述这些技术最恰当的话应当称其为——显微操作,因为这些操作是通过单个的或多个的筒状玻璃微量移液管、精确的定位装置(显微操作器)以及微量注射器或微量灌注器来在单个的细胞上进行的。

显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等,例如多莉羊就是运用细胞核移植技术而成功的;而转基因技术指的是将外源基因导入体细胞并能稳定的嵌入宿主动物的生殖细胞染色体中的一门技术,基因转殖动物被定义为由人为的方式将外源基因引入体内而引起基因改变的动物,并可将遗传特质传递到接续的每一世代中。

微注射应用的范围非常广泛,从辅助(体外)细胞受精技术至分子和细胞基本组分的转运都需使用这一技术,比较典型的是将某些物质注射进细胞中以操作和/或监测某种特定的存活细胞中的基本机体生物化学状态。这些可以注射进细胞的物质包括有:各种细胞器、激酶、组织化学标志物(比如辣根过氧化物酶或者荧光黄)、蛋白质、代谢物质、微磁头、离子、抗体、基因、分子生物学的mRNA和DNA等等。运用这一技术,也可以实现用于单个细胞或一组细胞的较少量(皮升至毫升)药剂或药物的精确输送(微灌注),例如药理学的药物检验。转基因动物的制作,可以利用基因微注射(gene microinjection)、胚干细胞(embryonic stem cells,ES cells)、精子载体(sperm vector)、反转录病毒感染(retroviral vectorinfection)及体细胞核移置(somatic cell nucleartransfer)等方法达成,其中显微注射为目前应用最普遍之方法之一。

显微注射法(microinjection)是利用管尖极细(0.1至0.5μm)的玻璃微量注射针,将外源基因片段直接注射到原核期胚或培养的细胞中,然后藉由宿主基因组序列可能发生的重组(rearrangement)、缺失(deletion)、复制(duplication)或易位(translocation)等现象而使外源基因嵌入宿主的染色体内。这种显微注射术的程序,需有相当精密的显微操作设备,制造长管尖时,需用微量吸管拉长器(micropipettepuller),注射时需有固定管尖位置的微量操作器。这种技术的长处为任何DNA在原则上均可传入任何种类的细胞内。此法已成功运用于包括小鼠、鱼、大鼠、兔子及许多大型家畜,如牛、羊、猪等基因转殖动物。

以显微注射法转外源基因没有长度上的限制,目前已证明数百kb之DNA片段均可以成功产制出转基因动物。其缺点是设备精密而昂贵、操作技术需要长时间的练习,以及每次只能注射有限的细胞。这些操作中所使用的微量移液管是用毛细管拉针器(pipettepuller)来制作的,先将玻璃毛细管加热到其熔化的温度,再将其拉制成所需的合适大小的直径和锥形,微量移液管小头的直径(小至0.2微米)与纤维操纵器的高精度相关,它可以用于精准的移液。这种精确度可以为各种类型和任意大小的细胞提供亚皮克升级或0.1微米(micron)范围内的精确的、重复性良好的细胞内和细胞旁注射。通过运用直接的水压(压力注射)或者不通过使用水流,而通过施加一电场来使带电离子运动(离子电渗法),都可以获得将微量移液管中的物质挤喷出去的效果。

目前最常用来生产转基因动物的方式为:直接把重组过的 DNA 注入授精卵的原核(pronuleus) 中,将从胚胎提供者的输卵管中取得的授精卵移到倒置显微镜上的微量注射台上,然后利用固定吸量管 (holdingpipette) 固定住,之后注射针则依序穿过 zona pellucida,ocyte membrane 及malepronuleus membrane后,将 DNA注入,注入时可以见到原核膨大。以小鼠受精卵雄原核的显微注射为例,显微注射所使用的受精卵固定吸管(holdingpipette)及注射针(injectionneedle)制备很困难,除影响操作时间外,也是影响转基因效率及基因注入后之胚胎存活及转基因成功与否极其重要的因子。固定吸管之内、外径分别为30、80μm是较为合适的,显微注射针自针尖起20μm处的外径为4μm时,可获得良好的转染效率。固定吸管的内径如果太小,会导致吸力不足,对受精卵操控不易;如太大,则受精卵易受伤害,影响胚胎的存活率。显微注射针尖如果太粗,则导致插入透明带及原核的阻力增加,且DNA流量过多,受精卵易于裂解;太细则导致针内DNA流出速率过慢,且易阻塞,而使DNA无法顺利流入原核内,影响注射效率。因此进行受精卵雄原核的显微注射时,如何制备适用固定受精卵的吸管及显微注射针是关乎转基因效率极其重要的因素。

转基因动物(transgenicanimal)在目前生物及医学研究方面的应用极为广泛,转基因小鼠一直是研究外源基因构筑型态、染色体嵌插、转基因表现及调节的最佳模式,也是建立转基因技术最好的工具,尤其是在转基因家畜之前,先以小鼠进行预备试验是求事半功倍不可或缺的过程。

转基因动物应用的领域可以包括研究基因的活动对致癌病毒与癌细胞的生长的影响、基因的活动与免疫细胞间的交互作用与调控的机制、研究基因对于生长的调控机制,以及生物学与遗传学的机制,也被应用于以人类细胞作为组织及器官移植的发展方面,如基因参与体细胞、胚胎干细胞及存在各个组织的干细胞的体外诱导分化研究等等。转基因动物除用于一般基础研究外,对于制造具有治疗效果的蛋白质、器官移植、疫苗、毒理实验、动物品种改良及水产养殖等均有很大的贡献。虽然截至目前为止,转基因的研发已有若干良好的成果,但尚有若干问题待克服,所以转基因技术的应用与发展将是不可限量的。为了使科研人员能够顺利进行上述的实验并得到有意义的结果,这些实验中所使用的设备不仅应当有特殊的功能,还应当同时有很高的、过硬的质量,能够提供确保结果正确所需的可靠性、精确性以及可重复性。


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