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转基因小鼠制备实验方法


更新时间:2010-05-13



1、 选取7~8周龄雌性小鼠,阴道口封闭,作为供体,下午3:00左右,每只小鼠腹腔注射PMSG(10 IU)。

2、 47~48小时后,每只小鼠腹腔注射HCG(0.8 IU),并与正常公鼠合笼;另取数只适龄母鼠(2月龄以上)作为受体,阴道口潮红,与结扎公鼠合笼。

3、第二天上午9:00前观察供体、受体,有精栓者拿出备用。受体笼拿出作好隔离措施。

4、10:30左右,断颈处死供体,手术取出整个输卵管,放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。显微镜下,用镊子撕开输卵管壶腹部,受精卵随同颗粒细胞即一同流出。

5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵,当受精卵周围的颗粒细胞脱离时,将受精卵吸出,放入M2液中洗涤,最后放在M16液中放入5% CO2,37C0培养箱培养。

6、在显微镜下观察,挑选细胞饱满,透明带清晰,雄原核清晰可见的受精卵待用。

7、安装持卵针和注射针,使其末端平行于载物台,在凹玻片的中央滴入一滴M2液,覆盖石蜡油,移入待注射的受精卵。DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。

8、在高倍镜下,将注射针轻触持卵管,使DNA缓慢流出并控制其流量;反复吹吸受精卵,使其处于最佳位置,将注射针刺入受精卵的雄原核,直至看到原核膨大即退出。将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置,不致于混搅,注射完毕后,放入5% CO2,37C0培养箱培养。

9、将受体麻醉,注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g,腹腔注射。手术取出卵巢连接输卵管,用脂肪镊固定,在显微镜下找到输卵管开口。吸取注射后经培养成活的受精卵,吸取方法是先吸一段较长的M2,吸一个气泡,然后吸取受精卵,尽量紧密排列,再吸一段液体,吸一个气泡,再吸一段液体,共四段液体三个气泡。除较长的那段液体,其余的液体大致1cm左右,气泡0.2cm左右。将移植管口插入输卵管口,轻轻将移植管内的液体吹入,看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡,即移植成功。将卵巢连同输卵管放回腹腔,缝合肌肉和皮肤。

10、受体每隔一个星期称体重一次,当第二次比第一次称重增加时,即可初步判断怀孕。手术后19~21天仔鼠分娩,待仔鼠3周后,剪耳、编号,剪尾,交分子组检测。

(一般选取4-5周龄的雌鼠作为供体,此时的小鼠卵数较多,状态较好。用pms诱导卵细胞成熟,用hcg超排。)


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